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试剂盒内容

产品(pin)说明(ming)：

        本试剂(ji)盒(he)采用碱裂解法裂解细(xi)胞，根据离心(xin)吸附(fu)柱在高(gao)盐状态下(xia)特异性地结合溶(rong)液中的 DNA的(de)原理(li)特异性提取质粒(li)DNA。离心吸(xi)附(fu)柱中采(cai)用的(de)硅基质材料能高效(xiao)、专一(yi)地吸(xi)附(fu)DNA，可最大限度去除杂质蛋(dan)白及细胞中其他(ta)有机化合物。使用本试剂(ji)盒提取的(de)质粒(li)DNA可适用于各种常规操作(zuo)，包括酶切、PCR、测序、连接和转化(hua)等试(shi)验。

       使用前(qian)请先在漂洗液(ye)中加(jia)入无水乙(yi)醇，加(jia)入体积请参(can)照瓶(ping)体上的(de)标签。溶液(ye)Ⅰ在(zai)使用前(qian)先(xian)加入 RNaseA(将试剂盒(he)中(zhong)提(ti)供(gong)的 RNaseA 全部(bu)加入(ru))，混匀，置于 2-8℃保存(cun)。如(ru)非指明，所有离心(xin)步骤(zhou)均为使用台(tai)式(shi)离心(xin)机在室温(wen)下(xia)离心(xin)。

操作步骤（仅(jin)供参考(kao)）：

1、取5 mL 细菌培(pei)养物，12000 rpm离心1 min，尽量吸(xi)除上清(qing)(菌液较多时可以(yi)通过多次离心(xin)将(jiang)菌体沉淀收(shou)集到一个2 mL 离(li)心管中)。

2、向(xiang)留有菌(jun)体沉淀的离心管中加入(ru)  250 μL  溶液Ⅰ(请(qing)先检查是(shi)否已加(jia)入RNaseA)，使用(yong)移(yi)液器(qi)或旋涡振荡(dang)器(qi)彻底悬(xuan)浮细(xi)菌细(xi)胞沉淀。注意(yi):如果菌块未彻底混匀，会影响(xiang)裂解导致质粒提取量(liang)和纯度偏低(di)。

3、向离心(xin)管中加入250 μL溶(rong)液Ⅱ，温和地上下翻(fan)转6-8次(ci)使菌体(ti)充分裂(lie)解。注(zhu)意(yi):混(hun)匀一(yi)定要温和(he)以免污染细(xi)菌基因组DNA，此时(shi)菌液应变得清亮粘稠，作用时(shi)间不要超过5 min，以免质粒受到破坏。

4、向离心(xin)管中加入(ru)350 μL溶液(ye)Ⅲ，立即温和地上下(xia)翻转(zhuan)6-8次，充(chong)分混匀，此时(shi)会(hui)出现白(bai)色(se)絮沉淀。12000 rpm离心10 min，用(yong)移(yi)液器小心地(di)将(jiang)上清转移(yi)到另一个干净的离心管中，尽量不(bu)要吸出(chu)沉淀。注意:溶液Ⅲ加入后应(ying)立即混合，避免产生局部沉(chen)淀(dian)。如果(guo)上清(qing)中还(hai)有(you)微小白(bai)色(se)沉(chen)淀(dian)，可再次(ci)离心(xin)后取上清(qing)。

5、将上(shang)一(yi)步所得上(shang)清液加(jia)入吸附柱中(吸附柱加入收集管中)，空温放(fang)置2 min，12000 rpm离心1 min，倒(dao)掉(diao)收集(ji)管中的废液，将(jiang)吸(xi)附柱重(zhong)新放回收集(ji)管中。

6、向(xiang)吸附(fu)柱中(zhong)加入500 μL漂洗液Ⅰ(使用前请先检(jian)查是否已加(jia)入(ru)无水(shui)乙醇(chun))，12000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

7、向吸附柱中加入(ru)700 μL漂洗液Ⅱ(使(shi)用前请先(xian)检查是否已加入无水(shui)乙醇)，12000 rpm离心(xin)1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

8、向吸附(fu)柱中加入700 μL漂洗液Ⅱ，12000 rpm 离心1 min，弃废液(ye)，将吸附柱放(fang)入(ru)收集管(guan)中。

9、12000 rpm离心(xin)2 min，将吸附(fu)柱敞口置于(yu)室温或50 ℃温箱放(fang)置数分(fen)钟，目的(de)是将吸(xi)附柱中残余的(de)漂(piao)洗(xi)液(ye)去除，否则漂(piao)洗(xi)液(ye)中的(de)乙醇会影响后续的(de)实验如酶切、PCR等。

10、将吸附柱放(fang)入一个干净的离(li)心管中，向(xiang)吸附膜中央悬(xuan)空滴加(jia)50-200 μL经65℃水浴热(re)的洗脱液(ye)，室温放置2 min，12000 rpm离(li)心1 min。

11、为了增加(jia)质粒的回(hui)收(shou)效率(lv)，可将得(de)到的洗脱液(ye)重新加(jia)入吸附柱中，室温放(fang)置2 min，12000 rpm离心1 min。

注意(yi)事项：

1、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是(shi)否(fou)出现混浊(zhuo)，如有混浊(zhuo)现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，待(dai)溶液(ye)恢(hui)复澄清后再使用。溶液(ye)Ⅱ、溶液Ⅲ、漂洗液Ⅰ和(he)漂(piao)洗液Ⅱ使用后应(ying)立(li)即拧(ning)紧(jin)盖子。

2、洗脱缓冲液体积(ji)不(bu)应少于100μL，体积过小影响回收效率；洗脱液的(de)pH值对洗(xi)脱(tuo)效率也有影(ying)响，若(ruo)需要(yao)用水做洗(xi)脱(tuo)液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调(diao)至此(ci)范围(wei))，pH值低(di)于7.0会(hui)降(jiang)低洗(xi)脱(tuo)效率，DNA产物应(ying)保存在-20℃，以防 DNA 降解。

3、DNA浓度(du)及纯(chun)度(du)检测：得到的质粒DNA纯度与(yu)样品保存(cun)时间、操作过程中的剪切力等因(yin)素有(you)关。得到的DNA可(ke)用琼(qiong)脂糖疑(yi)胶电泳和(he)紫外分光光度计检测浓(nong)度与纯度。DNA应在OD₂₆₀处有(you)显著(zhu)吸(xi)收峰，OD₂₆₀值为1相(xiang)当于大约50ug/mL双(shuang)链DNA、40ug/mL单链DNA。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值(zhi)应(ying)为1.7-1.9，如果洗脱(tuo)时不使用洗脱(tuo)缓冲液(ye)，而使用去离(li)子水(shui)，比值会偏低，因为pH值(zhi)和离子存在会(hui)影响(xiang)吸(xi)光(guang)值(zhi)，但并不表示纯度低。