澳门六开彩开奖结果历史

试剂盒内容(rong)

产品(pin)说(shuo)明：

        本试(shi)剂盒采(cai)用碱裂解(jie)法裂解(jie)细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结(jie)合溶液中的(de) DNA的原理(li)特异性提取(qu)质粒DNA。离心吸附(fu)柱中采(cai)用的硅(gui)基质(zhi)材料能高效、专一地吸附(fu)DNA，可最大限度去(qu)除杂(za)质(zhi)蛋白及(ji)细胞中其他(ta)有机化合(he)物。使(shi)用本试剂盒提取(qu)的质(zhi)粒DNA可适用于各(ge)种(zhong)常(chang)规操作，包括(kuo)酶切、PCR、测序(xu)、连接和转化(hua)等(deng)试验。

       使用(yong)前(qian)请(qing)先在漂洗液(ye)中加入无水乙醇，加入体积请(qing)参照瓶体上(shang)的标签。溶液(ye)Ⅰ在(zai)使用(yong)前先(xian)加入 RNaseA(将试剂盒中(zhong)提供的 RNaseA 全部加入(ru))，混匀(yun)，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离(li)心(xin)步骤均为使用台式离(li)心(xin)机(ji)在室(shi)温下离(li)心(xin)。

操作步骤（仅(jin)供参考(kao)）：

1、取5 mL 细菌培养物，12000 rpm离心1 min，尽量吸除(chu)上清(菌液较多(duo)时可以通过多(duo)次离(li)心将菌体(ti)沉淀收集到一个2 mL 离(li)心(xin)管中)。

2、向留(liu)有(you)菌体沉淀的离心管中加入  250 μL  溶液(ye)Ⅰ(请先检查是(shi)否已加入RNaseA)，使用移液器(qi)或旋(xuan)涡振(zhen)荡(dang)器(qi)彻底悬浮细菌细胞沉淀(dian)。注意:如果菌块未彻底混(hun)匀，会影响裂解(jie)导致质粒提取量(liang)和纯度偏(pian)低。

3、向离心管中加入250 μL溶液(ye)Ⅱ，温和(he)地上下翻转(zhuan)6-8次使菌(jun)体充(chong)分裂解。注意:混匀(yun)一定要温和以(yi)免(mian)污染细菌基(ji)因组DNA，此(ci)时(shi)菌(jun)液(ye)应变得清(qing)亮粘稠，作用(yong)时(shi)间不要超过5 min，以免质粒受到破坏。

4、向(xiang)离心(xin)管中加入350 μL溶液Ⅲ，立(li)即温和地(di)上下翻转6-8次，充分混(hun)匀，此时会出现(xian)白色絮沉淀(dian)。12000 rpm离心10 min，用移液器小(xiao)心地将上清转移到另一个干净的离心管(guan)中，尽量(liang)不要吸出沉淀。注意(yi):溶液(ye)Ⅲ加(jia)入后应立即混合，避免产生局部沉淀(dian)。如果上(shang)清中还有微小(xiao)白(bai)色沉淀(dian)，可再次离心后取(qu)上(shang)清。

5、将(jiang)上一步所得上清液(ye)加入吸附柱中(吸附柱加入(ru)收集管中(zhong))，空温放置(zhi)2 min，12000 rpm离心1 min，倒掉收集(ji)管(guan)中的(de)废液，将吸(xi)附柱(zhu)重新放(fang)回收集(ji)管(guan)中。

6、向吸附柱中加入500 μL漂洗液Ⅰ(使用前请(qing)先检查是否(fou)已加入(ru)无水(shui)乙醇(chun))，12000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放入(ru)收集管(guan)中。

7、向(xiang)吸(xi)附柱中加入(ru)700 μL漂洗液(ye)Ⅱ(使用前请先检查是(shi)否已加入(ru)无水乙醇)，12000 rpm离心1 min，弃废(fei)液，将吸附(fu)柱放入收集管中(zhong)。

8、向吸附柱中加(jia)入700 μL漂(piao)洗液Ⅱ，12000 rpm 离心1 min，弃废(fei)液，将(jiang)吸(xi)附柱放入收集管中(zhong)。

9、12000 rpm离心2 min，将吸附柱敞口(kou)置(zhi)于(yu)室温或50 ℃温(wen)箱放置数分钟，目的(de)是将吸附柱中残余的(de)漂洗液去除，否则漂洗液中的(de)乙(yi)醇(chun)会影响后续的(de)实验如酶切(qie)、PCR等。

10、将吸(xi)附柱(zhu)放(fang)入一个干净的离心(xin)管中，向(xiang)吸(xi)附膜(mo)中央悬空(kong)滴加(jia)50-200 μL经65℃水浴热的(de)洗脱液(ye)，室(shi)温放置2 min，12000 rpm离心1 min。

11、为了增加质粒(li)的回收效率，可将得到的洗脱液重(zhong)新加入吸附(fu)柱(zhu)中，室温放(fang)置2 min，12000 rpm离心1 min。

注意事项：

1、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液(ye)Ⅲ是否(fou)出(chu)现混(hun)浊，如有混(hun)浊现象，可在 37℃水浴中(zhong)加热(re)几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶(rong)液(ye)Ⅲ、漂洗液Ⅰ和漂洗液Ⅱ使(shi)用后应立即拧紧盖子。

2、洗(xi)脱缓冲(chong)液体积(ji)不应少于100μL，体积过小影(ying)响回收效率；洗脱液的pH值对(dui)洗脱(tuo)效率也有影响，若需要用水(shui)做洗脱(tuo)液应保证其pH值(zhi)在8.0左右(可用(yong)NaOH将水的pH值调至此(ci)范围)，pH值低(di)于7.0会降(jiang)低(di)洗脱效率，DNA产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。

3、DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度(du)与样品保存(cun)时间、操作(zuo)过程中(zhong)的剪(jian)切力等因素有关。得(de)到的DNA可用琼脂糖疑(yi)胶电泳(yong)和紫外分光(guang)光(guang)度(du)计检测浓度(du)与纯度(du)。DNA应(ying)在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀值(zhi)为1相当于大(da)约50ug/mL双链DNA、40ug/mL单链(lian)DNA。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应(ying)为1.7-1.9，如果(guo)洗脱时不(bu)使用洗脱缓冲液(ye)，而使用去(qu)离子水，比(bi)值会偏低(di)，因为pH值和(he)离子存在会影响吸光值，但并(bing)不表示(shi)纯度低。